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用FastQC检查高通量测序原始数据的质量

时间:2015-12-26 20:53:42      阅读:5342      评论:0      收藏:0      [点我收藏+]

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本篇文章,主要参考了阳光1986的博文(http://www.dxy.cn/bbs/topic/31324367),自己测序的分析结果作为对比,加在其中了。

 

1.简介

当二代测序的原始数据拿到手之后,第一步要做的就是看一看原始reads的质量。常用的工具就是fastqc (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。

fastqc的详细使用说明:http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/


2. 安装

$ wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.3.zip
$ unzip fastqc_v0.11.3.zip
$ cd FastQC/
$ chmod 755 fastqc
$ echo "export PATH=`pwd`:$PATH" >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc
$ fastqc –help

 


3. 服务器上用命令行来运行fastqc

fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] seqfile1 .. seqfileN

-o 用来指定输出文件的目录,fastq是不能新建目录的。输出的结果是.zip文件,默认自动解压缩,如果加上--noextract参数则不解压缩。

-f 用来强制指定输入文件格式,默认会自动检测。

-c用来指定一个contaminant文件,fastqc会把overrepresented sequences去这个contaminant文件里搜索。contaminant文件的格式是"Name\tSequences",#开头的行是注释。

-q 会进入沉默模式,即不出现下面的提示:
Started analysis of target.fq
Approx 5% complete for target.fq
Approx 10% complete for target.fq

4. 结果解析

如果输入的fastq文件名是target.fq,fastqc的输出的压缩文件将是target.fq_fastqc.zip。解压后,查看html格式的结果报告。结果分为如下几项:

0) summary

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结果分为绿色的"PASS",黄色的"WARN"和红色的"FAIL"。“You should treat the summary evaluations therefore as pointers to where you should concentrate your attention and understand why your library may not look random and diverse. ”

 

1) Basic statistics

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2) Per base sequence quality

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quality就是Fred值,-10*log10(p),p为测错的概率。所以一条reads某位置出错概率为0.01时,其quality就是20。横轴代表位置,纵轴quality。红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。
若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25,报"WARN";若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20,报"FAIL".

 

3) Per Sequence Quality Scores

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每条reads的quality的均值的分布:横轴为quality,纵轴是reads数目。当出现上面的第二幅的情况时,我们就会知道有一部分reads具有比较差的质量。当峰值小于27(错误率0.2%)时报"WARN",当峰值小于20(错误率1%)时报"FAIL"。

4) Per Base Sequence Content

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对所有reads的每一个位置,统计ATCG四种碱基(正常情况)的分布:

如果建库足够均匀,reads的每个位置应当是没有差异的,所以GC含量的线应当平行于X轴,反映样品(基因组、转录组等)的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时,往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时,往往代表文库有bias (建库过程或本身特点),或者是测序中的系统误差。当任一位置的GC含量偏离均值的5%时,报"WARN";当任一位置的GC含量偏离均值的10%时,报"FAIL"。

5) Per Base GC Content

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对所有reads的每个位置,统计GC含量。

如果建库足够均匀,reads的每个位置应当是没有差异的,所以GC含量的线应当平行于X轴,反映样品(基因组、转录组等)的GC含量。当部分位置GC含量出现bias时,往往提示我们有overrepresented sequence的污染。当所有位置的GC含量一致的表现出bias时,往往代表文库有bias (建库过程或本身特点),或者是测序中的系统误差。当任一位置的GC含量偏离均值的5%时,报"WARN";当任一位置的GC含量偏离均值的10%时,报"FAIL"。

6) Per Sequence GC Content

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对所有reads的每个位置,统计GC含量。

红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。 曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差(overrepresented reads)。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。
偏离理论分布的reads超过15%时,报"WARN";偏离理论分布的reads超过30%时,报"FAIL"。

7) Per Base N Content

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8) Sequence Length Distribution

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reads长度的分布

当reads长度不一致时报"WARN";当有长度为0的read时报“FAIL”。

9) Duplicate Sequences

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统计序列完全一样的reads的频率。测序深度越高,越容易产生一定程度的duplication,这是正常的现象,但如果duplication的程度很高,就提示我们可能有bias的存在(如建库过程中的PCR duplication)

横坐标是duplication的次数,纵坐标是duplicated reads的数目,以unique reads的总数作为100%。 上图的情况中,相当于unique reads数目~20%的reads是观察到两个重复的,~7%是观察到三次重复的,依此类推。
可 以想象,如果原始数据很大(事实往往如此),做这样的统计将非常慢,所以fastqc中用fq数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重 复情况。重复数目大于等于10的reads被合并统计,这也是为什么我们看到上图的最右侧略有上扬。大于75bp的reads只取50bp(不知道怎么选 的)进行比较。但由于reads越长越不容易完全相同(由测序错误导致),所以其重复程度仍有可能被低估。

10 Overrepresented Sequences
如 果有某个序列大量出现,就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样,为了计算方便,只取了fq数据的前200,000条reads进行统计,所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加l入了-c参数,则出现的over-represented sequence会从contaminant_file里面找匹配的hit(至少20bp且最多一个mismatch),可以给我们一些线索。当发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“,当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“。

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原文地址:http://www.cnblogs.com/longjianggu/p/5078782.html

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