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Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expresssion at high spatial resolution
摘要
细胞在组织中的空间位置强烈影响者它们的功能，然而，目前缺乏可高通量且全基因组范围内在单细胞水平对基因表达进行准确捕获的技术。原文作者开发了Slide-seq技术，这是一种将组织切片中的RNA转移到表面的方法，表面覆盖有已知位置的DNA条形码珠，通过测序可以推断出RNA的位置。使用Slide-seq技术将单细胞转录组测序数据鉴定的细胞类型定位在小脑和海马内，表征小鼠小脑Purkinje层的基因空间表达模式，并定义创伤性脑损伤小鼠模型中细胞类型特异性反应的时间演变。这些研究强调了Slide-seq如何提供一种可扩展的方法，以单细胞水平的分辨率获得空间解析的基因表达数据。
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前言
复杂组织的功能与它们内部的细胞类型组成紧密有关。多重原位杂交和基于测序的方法可以测量基因在亚细胞水平的空间表达情况(1-3 )，但需要专业的知识和设备，以及预先选择用于测量的基因组。相比之下，利用条形码寡核苷酸捕获阵列进行空间编码核糖核酸测序的技术仅限于几百微米(4)的分辨率，这不足以检测重要的组织特征。
为了开发用于高分辨率全基因组表达分析的Slide-seq技术，原文作者首先将独特的DNA条形码编码的10毫米微颗粒(“珠”)包装到橡胶涂层的玻璃盖玻片上，类似于Drop-seq的单细胞转录组测序技术，形成一个我们称为“圆盘”的单层。他们发现每个珠子不同的条形码序列可以通过固相化学(寡核苷酸连接和检测测序)来确定(图1A) (6-8)。他们接下来开发了一种方案，其中10毫米新鲜冷冻组织切片通过冷冻切片(7)转移到干燥的珠粒表面。从组织中释放的mRNA被捕获到用于制备3′-末端条形码核酸序列文库的珠子(5)(图1B)。来自小鼠海马冠状切片(7)的单个珠子轮廓的聚类产生了反映组织中细胞类型的已知位置的分配(图1C)。非常精细的空间特征被分辨出来，包括位于中央心室和小鼠大脑缰核之间的单细胞室管膜细胞层(图1C)。此外，载玻片序列可应用于一系列组织，包括小脑和嗅球，其中分层组织结构可立即检测到(图1D)，以及肝脏和肾脏，其中所识别的簇分别显示肝细胞分带模式(9)和肾单位的细胞成分。人体去世后的切片序列也成功地捕捉到了在同源小鼠组织中观察到的相同结构特征。通过Slide-seq技术进行的表达测量与来自大量RNA-seq和单细胞转录组测序技术scRNA-seq一致，并且每个细胞的平均基因转录物捕获在组织和实验中是一致的。最后，通过Slide-seq和荧光原位杂交分析的脑结构尺寸中，没有发现明显的差异，这意味着mRNA以最小的横向扩散从组织转移到珠子。
为了将单细胞转录组测序技术scRNA-seq的细胞类型映射到Slide-seq的数据上，作者开发了一种称为非负矩阵分解回归(NMFreg)的计算方法，它将每个Slide-seq珠的表达重构为scRNA-seq定义的细胞类型特征的加权组合(图2A)。将NMFreg应用于小鼠冠状小脑圆盘概括了经典神经元和非神经元细胞类型(10)的空间分布，例如颗粒细胞、高尔基中间神经元、单极刷状细胞、Purkinje细胞和少突胶质细胞(图2B)。NMFreg的映射被发现在一系列因子数和随机重启中是可靠的。作者发现65.8±1.4%的珠子可以与单个细胞类型(7)相匹配，而32.6±1.2%的珠子显示来自两种细胞类型(平均标准差，N = 7小脑pucks)(图2C)。Slide-seq的高空间分辨率是绘制细胞类型的关键:当数据被聚集成更大的特征尺寸时，组织的异质区域中的细胞类型不能被解析。Slide-seq收集3D组织体积的二维(2D)空间样本，因此，在没有适当的体视学控制和采样方法的情况下，在对整个3D体积进行绝对计数测量时应小心谨慎(11)。
作者首先对从单个小鼠背侧海马区使用pucks捕获的66个矢状组织切片，覆盖9毫米的体积，背侧-腹侧轴和前-后轴分辨率约为10毫米，内侧-外侧轴分辨率约为20毫米(交替的10毫米切片)。150万个珠子，其中770，000个可以用NMFreg与单个ScRNA-seq定义的细胞类型相关联，被映射到相应的shor-read数据上。作者沿着内侧-外侧轴计算地共同配准pucks，允许三维可视化海马体中的细胞类型和基因表达(图2D)。作者绘制了由先前定义的齿状回标记(10)、CA2、CA3、下丘亚群、前定位CA1亚群(以标记Tenm3为例)和经历有丝分裂和神经发生的细胞组成的基因族。基因族高度表达，并对预期区域具有特异性(图2E)，证实了Slide-seq定位普通细胞类型和更精细细胞亚群的能力。这66个pucks的整个实验过程(不包括圆盘的产生)需要大约40人/小时(7)并且只有标准的实验设备。
然后，作者开发了一种非参数的、无核的算法来识别pucks上空间非随机分布的基因(7)。将该算法应用于冠状切片小脑，将Ogfrl1、Prkcd和Atp2b1识别为高度定位于小脑正下方的区域。特别是，作者发现Ogfrl1是耳蜗背核分子层和梭形层，可能是耳蜗背核车轮细胞(12，13)中细小白蛋白中间神经元的一种特异性和前所未有的标记。作者的算法还鉴定了仅在原发性裂[之前的颗粒细胞中表达的Rasgrf1， (14)，并且进一步的分析揭示了仅在原发性裂(7)之后表达的四个先前未表征的基因。
小脑的特点是Purkinje的矢状旁带基因表达，与Purkinje细胞生理学和投射靶点的异质性相关(15-18)。几个基因，包括Aldoc(也称为zebrin II抗体的抗原)，显示出相似或互补的副矢状体表达(17，19，20)，但这种表达变异的程度未知，并且这些模式在单细胞测序研究中尚未明确鉴定。利用Slide-seq收集的空间信息，作者鉴定了Purkinje层中的669个空间非随机基因，其中126个基因与zebrin 模式相关或反相关，分别使用Aldoc和Plcb4作为zebrin patternII-阳性或zebrin II-阴性带的标记(图3A)。在抗相关基因中有四个腺苷三磷酸酶和四个钾通道，其中一些可以解释zebrin阳性和zebrin阴性Purkinje神经元在电生理学上的差异。此外，除了zebrin模式之外，作者还发现了其他几种空间基因表达模式。尽管大多数被鉴定的基因显示出与zebrin II染色一致的模式(图3)，但有几个基因在外前庭小脑区(小叶IX和X) 排外地表达或被排除在外(21，22)(图3D)，证实小叶IX和X具有不同的基因表达程序。还有其他基因在[表现出排斥性表达，例如B3galt5 (7，23)]或排除在(例如Gnai1)第九和第十小叶以及第六和第七小叶之外，表明这些区域可能共享一种基因表达模式，尽管与其相关的认知角色不同 (24)。最后，尽管以前只有Purkinje细胞与醛固酮模式相关，但作者发现，以前主要在肌肉中研究的博格曼细胞标记物Mybpc1在玻片序列和原位数据中似乎都具有zebrin表达模式。因此，作者得出结论，带状基因表达模式将许多小脑细胞类型——包括Purkinje、Bergmann神经胶质细胞和颗粒细胞——分成空间上确定的亚群，这在以前的单细胞测序研究中并未指出(10，25)。
最后，作者应用滑动序列来量化大脑对创伤性脑损伤的反应时间到了。通过损伤后2小时血红蛋白转录物的存在(图4A)或损伤后3天和2周Vim、Gfap和Ctsd转录物的存在(图4、B和C) (7)，在Slide-seq数据中可见皮质损伤。选择Vim、Gfap和Ctsd是因为它们是星形胶质细胞(Vim和Gfap)或小胶质细胞(Vim和Ctsd)反应的已知标记，在Slide-seq数据中发现这些反应在损伤时高度上调。作者应用了一种算法来识别所有在空间上与这些转录本相关的基因(7)。在2小时的时间点，仅发现Fos和核糖体核糖核酸(rRNA) (26)与损伤在空间上相关(图4A)。相比之下，在3天的时间点，作者发现小胶质细胞和巨噬细胞分配的珠位于损伤部位，由表达有丝分裂相关因子的不同细胞层(厚度:92.4±11.3毫米，mean ± SE,，N = 3测量值)界定，随后是星形胶质细胞分配的珠层(图4D)。最后，在2周的时间点，作者观察到小胶质细胞和巨噬细胞分配的珠填充损伤，周围有星形胶质细胞疤痕(厚度: 36.6 ±13.4毫米，mean ± SE,，N= 6次测量)，有证据表明小胶质细胞(但不是巨噬细胞)穿透39±17.8毫米(mean ± SE,，N= 6次测量)，穿过星形胶质细胞瘢痕并进入富含神经元的区域(图4，E和F)。巨噬细胞使用Lyz2可视化，Lyz2是巨噬细胞和粒细胞的特异性标记；然而，作者将其解释为巨噬细胞的标志物，因为没有发现其他粒细胞特异性标志物与Gfap、Ctsd和Vim共定位。
为了研究3天和2周时间点之间基因表达的其他变化，作者鉴定了在3天或2周时间点与Vim、Gfap和Ctsd空间相关的基因(7)。应用基因本体论（Gene Ontology）对这些基因组的分析揭示了在3天时间点与染色质分离、有丝分裂和细胞分裂相关的注释富集(图4G)，以及在2周时间点与免疫反应(图4H)、胶质生成(图4I)和少突胶质细胞发育(图4J)相关的富集。这一发现表明，细胞增殖发生在损伤后的最初几天，并在几周左右向分化过渡。例如，虽然在局灶性灰质损伤后少突胶质细胞祖细胞分化为少突胶质细胞的程度有争议(27)，但作者证实Sox4和Sox10在2周时间点都位于损伤周围的区域，表明存在固有的少突胶质细胞。作者还揭示了几个直接的早期基因的证据，包括高度神经元特异性基因，如Npas4，在损伤周围0.72±0.19毫米(mean ± SE，N = 4测量值)的宽度区域，在3天和2周时间点(2830)上调(图4K)，表明损伤对损伤周围大面积神经活动的持续影响。
作者的研究表明，Slide-seq能够对冷冻组织中的基因表达进行空间分析，具有高空间分辨率和对大组织体积的可扩展性。Slide-seq很容易与大规模单细胞转录组测序scRNA-seq数据集整合，有助于在正常和患病组织中发现空间定义的基因表达模式。Slide-seq的主要成本是short-read测序的成本，这里展示的pucks的成本约为200到500美元。随着测序成本的进一步下降，期望能够将载玻片序列扩展到整个器官，甚至整个生物体。作者预计Slide-seq将有助于在复杂组织中定位分子明确的细胞类型，从而定义神经病理状态中涉及的分子通路。
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